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hydrolytisches Enzym (Hydrolase) , welches Peptidbindungen spalten kann

Glucose -> 2 Pyruvat -> 2 Acetaldehyd -> 2 Ethanol

Stärke , Zucker, Cellulose, Inulin

1.Oberflächenverfahren (Vergährung an der Oberfläche , Dauer 6-12 Monate)
2.Tropfkörperverfahren (z.N Schützenbach, Genratorverfahren)
3.Submersverfahren

Branntweinessig
Weinessig
Malzessig
Apfelweinessig
Reisessig
Tomatenessig

1 Verkleisterung ( Hydratisierung)
2. Verflüssigung ( Dextrinierung)
3.Verzuckerung
4.Isomerisierung

-> Glucose/Fructose Sirup

Enantiomeric ratio ... Verhältnis der beiden Enantiomeren kcat werte zueinander

1. Anforderungen an ein neues Enzym
2.Erstellen einer Metagenom Bibliothek
3.Funktionelles und strukturelles screenig auf neue Enzyme
4. Enzymkandidaten
5.Pilot-scale Prozess
6.Enzym kann in der Biokatalyse angewendet werden

Enzymklasse : Hydrolasen
Substrat : Peptidbindungen knüpfen und spaltem
Gleichung

Cysteinproteasen
Serinproteasen
Carboxyproteasen
Metalloproteasen

Analysieren der unterschiedlichen Ströme mithilfe der C13-MFA Methode

Vorteile
- Einfache Handhabung und geringer Zeitbedarf
-Transformation ganzer Plasmide

Nachteile:
-Viele Frameshifts
-Hohe Transitionsbevorzugung
-keine Kopplung von Organismen möglich

Aromabildung
Verdauungshilfe
Futtermittelzusatz
Herstellung von strukturierten Tryglyceriden
-Modifikation natürlicher Fette und Öle
-Herstellung von Zuckerestern von Speisefettsäuren als Emulgatoren

Proteolyse (Eier?)
Chemische Herstellung aus Vorstufen
Mikrobielle Fermentation

Da Lactose bei der Spaltung in Glucose und Galactose umgewandelt wird , muss die Bindung der Glucose an CAP unterbunden werden damit das Lac Operon weiterhin funktioniert.

Nutzung der Immobilisierung. Hydrophobe Beads können dazu führen , dass der "Deckel" der Lipase dauerhaft geöffnet bleibt.

Rational: Temperaturstabilität, Aktivität, Selektivität
Gelenkt: LM-Stabilität, pH-Stabilität, Substrat/Produktstabilität

Vorliegen einer Kristallstruktur oder eines Homologie-Modells

(Methoden zur Vielfalt-Generierung nötig)
Random Mutagenese  kein Einfluss wo Mutation entsteht
Suche nach Eigenschaft, die „screening“-fähig
Vorhandensein eines geeigneten HTS
Mutantenbibliothek komplex genug, um auch seltene, vorteilhafte Mutationen
dabei
(Hoher Zeitaufwand 6-9 Monate)

Rational: 1 Woche
Gelenkt: 6-9 Monate

Vektor DNA i.d.R größer als Gen (z.B. 4 kbp zu 1-2 kbp)
Mutationen bevorzugt im Vektor außerhalb des Gens
über Änderungen im Promoter etc. Expressionsvarianten generiert ohne Mutationen im Gen  -> Wildtyp-Gensequenz bleibt erhalten

Verlust des (Mutator-)Plasmids
Stopp der Mutationsgenerierung

Didesoxy - Nukleotide (ddATP,ddCTP, ddGTP, ddTTP) jeweils in vier verschiedenen
Ansätzen, versehen mit Farbsignal
Einbau statistisch an jeder Position im Gen
Beendigung der Polymerisierung nach Einbau des Didesoxy - Nukleotids
Auftrennung über Agarosegelelektrophorese der Länge nach, das Farbnukleotid befindet
sich jeweils am Ende des Stranges
Ablesen des Farbcodes

Microarray
mRNA wird in cDNA umgeschrieben und mit Fluorescence (rot /grün) gelabelt
spezifische Bindung an Chip
An der Farbe erkennt man die Expression eines Proteins
halb/halb = gelb

Protein, was Metabolit spezifisch binden kann, ist mit zwei fluoreszierenden Proteinen  (A+B) assoziiert, welche bei unterschiedlicher Wellenlänge angeregt werden und
fluoreszieren und sich in einiger Entfernung zueinander befinden, solange kein Metabolit am Bindeprotein gebunden hat.
Die Lösung/Zelle wird mit der Anregungswellenlänge des einen Proteins (A) bestrahlt und eine entsprechende Lichtemittierung erfolgt.
Bindet ein Ligand an das Bindeprotein, kommen sich Fluoreszenzproteine durch  Konformationsänderungen im Bindeprotein näher und Energie wird vom einen(A) zum
anderen Protein(B) übertragen und das andere Protein (B) emittiert Licht bei der Anregungswellenlänge des einen (A).

Textilindustrie
Waschmittelindustrie
Papierindustrie
Lebensmittelindustrie
Lederverarbeitung

Fluxomics
Metabolomics
Genomics
Proteomics
Transkriptomics

Lactobacillus delbrückii
Lactobacillus  leichmanii

Stärke -Dampf-Amylase-Gelatinierun-> Verflüssigung/Verzuckerung -S.cerevisiae -> Gährung -Dampf -> Destillation/Rektifikation -> Ethanol ( Schlempe wird abgezogen)

Katalytische Zentrum besteht aus einem Häm; auch akzeptieren: Tetraopyrolligand mit Eisenzentrum

R-H +NADPH+ O2 + H+ --> R-OH + NADP+ +H2O

Verbesserung der Vorstufe -> Zerstören von Pyk führt zu 40% höheren Ausbeuten

Überproduktion von L-serin genen

Deregulation der Schlüsselenzyme

Verhindern von Serin Abbau

Verbesserter Serin Export

produziert etwa 20% des verfügbaren sauerstoffs auf der erde

Biosynthese:  Abbau von Xenobiotika, Steroid metabolismus, Festtsäuremetabolismus, Vitamin D

Medizinisch: Entgiftungsfunktion (Parathion, Phenol Beispiel), Cazinogenese (Aromatische Amine), Steroide (Anabolika)

Lipasen, Proteasen
thermostabil, hohe Aktivität in basischem Milieu, keine Autoproteolyse

Plasmide, die spezifische, vom Lambda-Phagen abgeleitete Sequenzen (cos-sites) besitzen und große Mengen DNA (40-50 kbp)aufnehmen können. Die cos-sites können zum Ring ligiert
werden.

das Gen ist nicht vollständig auf dem Plasmid vorhanden und kann deshalb nicht zum korrekten Protein exprimiert werden.

das Gen befindet sich sehr weit vom Promoter entfernt und wird von der Polymerase nicht abgelesen.

Z.B Glycerin verestert mit fettsäuren -> Lipase trennt fettsäuren ab
Glycerin und fettsäuren werden zum alkohol

Lipase besitzt Deckel über dem katalytischen Zentrum.
Deckel geht auf, wenn Enzym mit organischer Phase
(Micellen) in Berührung kommt und Enzym ist aktiv.
Hohe Aktivitätssteigerung ab kritischer
Micellenkonzentration

Konzentration von Tensid in wässriger Lösung, bei der sich Micellen bilden

-> erhöhte Stabilität
-> heterogene Katalyse möglich
->leichtere Abtrennung
-> Geeignet für conti prozesse
-> viele Katalysatoren aauf kleinem Raum = erhöhte Produktivität

Nahrungs un Futtermittelindustrie als Zusätze
Chemische Industrie für Waschmittel
Lederverarbeitung

Verfahren zur Trennung von Racematen in ihre Enantiomere.

Homofermentativ
1 Glucose -> 2 Lactat
Heterofermentativ
1 Glucose -> Lactat + Ethanol + CO2

Nur homofermentative organismen für milchsäuregährung

Chemische Synthese
Proteinhydrolyse
mikrobielle Fermentation

E-Wert = (kcat/Km)R/(kcat/Km)s

ee (enantiomerenüberschuss) = (cr-cs)/cr+cs)

2-Brompentan mit einem Enantiomerenüberschuss von 90/% R-Enntiomer

Gute Selektivität, da der E-Wert aus der logarithmischen Funktion bedingt nie einen Wert größer als 200 annehmen kann.

Gute Selektivität bei gerigem Umsatz ... für biokatalyse eher ungeeignet

Monooxygenasen katalysieren den Sauerstoffübertrag auf das Häm im Blut

Stamm welcher fehlerhafte Polymerasen exprimiert und so zu Mutationen führt.
Mutator plasmid kannman in einen stamm einbringen um diesen zu mutieren

Autoproteolyse.

Synthese von inaktiven Vorstufen
Abspaltung der Pro-Sequenz steuerbar über pH-Wert
Immobilisierung.

Systembiologie = Zweig der Biowissenschaften, der versucht, biologische
Organismen in ihrer Gesamtheit zu verstehen (Omics!).

Synthetische Biologie = Interdisziplinäre Wissenschaft, die sich mit dem Design und der Konstruktion neuer biologischer Funktionen und Systeme, welche in der Natur nicht vorkommen beschäftigt.

Umgehung/Überwindung/Modifizierung zellulärer Regulationsmechanismen, um Produkte in größeren Mengen zu erhalten.

Ultra high-troughput DNA sequencing
OMICS Technologien
Gensynthese
Klonieren knock out /knock in von genen
Protein engineering
Metagenomik

primär = Stoffwechselprodukte/-intermediate, die zum Wachstum und Überleben des Organismus notwendig sind. Bsp: Ethanol

sekundär = Stoffwechselprodukte/-intermediate, die zum Wachstum und Überleben des Organismus nicht notwendig zu sein scheinen. Bsp: Antibiotika

Veränderung des Synsthesewegs -> Überexpression des limitierenden Enzyms
-> Identifikation der limitierenden Schritte
->Veränderung der Regulation

Veränderung des Zellmetabolismus um mehr Energie bereit zu stellen

Veränderung des Transportweges

Verbesserung der Substrattoleranz

Entkopplung von Wachstum und Produktion

1. Finden des "Gen of interest"
2. Generierung von Mutanten
3. Screening auf Verbesserungen
4.Isolation des Gens , welches die Verbessrung codiert oder iterativ von neuem beginnen, bis die gewünschte Verbesserung vorhanden ist.

Forschungsgebiet der Biowissenschaften, das mit modernen molekularbiologischen
Methoden die Gesamtheit des Genoms eines Biotops zu erfassen versucht. Attraktiv, da
Mikroorganismen nicht kultiviert werden müssen und nur DNA isoliert werden muss.

-nein, würde er nicht überleben, dader Citratzyklus essentiell zur Energiegewinnung und Bildung von  Zwischenprodukten für Anabolismus ist

inhibiertes Enzym modifiizeren, damit Produkt nicht binden kann

in Loop-Regionen bei gegenüberliegenden Loops Aminosäuren mit entgegengesetzt
geladenen Resten einbauen, z.B. Lysin und Aspartat.

z. B. Aktivität des Enzyms durch Mutagenese verbessern oder dafür sorgen, dass das Gen
mehr exprimiert wird (stärkerer Promotor, Tandem Repeats), um die schlechte Aktivität durch
die Enzymmenge zu kompensieren.

Synthetische Biologie ist das rationale Modellieren, Konstruieren,Korrigieren und testen künstlicher lebender Systeme.

Parts-> Devices -> System

DNA Synthese
DNA Sequenzierung
Selektion
Klonierung
Regulation

Limitationen: Analyse und verständnis lebendiger systeme muss gegeben sein
Vernetzung von metabolitwegen , manweiß nir so ganz genau worauf es sich alles auswirkt
Sehr komplexe Metabolitwege

DNA, welche nur die für das Leben eines Organismus essenziellen Gene beinhaltet

Räumliche Kompartementisierung
Zeitliche "
Funktionelle "

Entkopplung von Stoffwechselwegen
-> Inhibierung vonProtein/Metabolitinteraktionen
->Nutzung alternativer Metabolite

cAMP = Second messenger , Aktivierung von CAP , Briegender DNA damit polymerase besser binden kann : Nur bei Glucosemangel

1. Entnahme einer Bodenprobe
2. Isolieren von DNA / RNA
3.Sequenzierung und Analyse
4. Klonieren und Erstellen einer Bilbliothek
5.Screening auf Funktion und Struktur

Screeningerfolg nicht immer gegeben, da E. coli nicht für viele Proteine nicht der optimale
Expressionsstamm ist. Wegen posttranslationaler Modifikationen (z.B. Glykosylierung) oder
Ausbildung von Disulfidbrücken (Cytoplasma ist reduzierend).

basische, eukaryotische Proteine, welche für die Verpackung der DNA, aber auch für die Expression der Gene zuständig sind. Vier verschiedene Histone bilden ein Oktamer, um welchen sich die DNA wickeln kann.

Aktivität
Stabilität
Effizienz
Spezifität

4 Klassen
Serinproteasen (Subtilisin , Chemo-/Trypsin)
Cysteinproteasen ( Papain)
Carboxyproteasen (Chymosin , Pepsin)
Metalloproteasen (Thermolysin)

Amphiphlie Reagenzien, die einen hydrophoben und hydrophilen Charakter besitzen. Können die Oberflächenspannung herab setzen. Es gibt anionische, kationische un neutrale Detergenzien

Asparaginsäure- Histidin - Serin

Autoproteolyse der Enzyme, Die Proteinfragmente dienen als Nahrung für Mikroorganismen.

Sekretieren sehr gut und erleichtern somit die Aufreinigung enorm. Bis zu 20 g/L

Thermostabilität, pH-Stabilität, breites Substratspektrum

Bindungstasche durch Substitution größerer Aminosäuren kleiner machen.

Negativ geladene Aminosäuren für die Bindung der positiv geladenen Substrate einbauen.

Achtung: Bindung darf nicht zu stark und nicht zu schwach sein!