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Modellieren/Optimieren von biologischen Reaktionen

metabolischen Parametern, die man nur auf Grund des Massentransfers quantifizieren kann

Charakterisierung/Design von Bioreaktoren

Entwicklung von Prozess-Kontroll-Strategien

Scale up

Identifikation der kostenbestimmenden Schritte

Ein newtonsches Fluid ist ein Fluid mit linearem, unelastischem Fließverhalten, bei dem die Scherrate proportional zum Scherstress ist. Diese Flüssigkeiten werden durch die Viskosität charakterisiert.

Davon abweichendes Verhalten heißt nicht-newtonsch. Der Grund für das Verhalten ist eine Abnahme bzw. Zunahme der Wechselwirkungen in dem Fluid auf Grund der geänderten mikroskopischen Struktur.
Die Viskosität verändert sich, wenn man schneller dreht. Und dann ist die Viskosität an der Wand auch noch anders als am Rührer.


m = 1 newtonsch Flüssigkeit
m < 1Scherverdünntes Fluid
m > 1dilatante Scherverichtung

„In Phase“
Unter normalen Bedingungen rotiert die Flüssigkeit im Schüttelkolben „in Phase“, das heißt, sie bewegt sich synchron mit der Schüttelbewegung des Tablars.

„Außer Phase“
Unter bestimmten Bedingungen kann eine geschüttelte Kultur „außer Phase“ geraten. Dieser Zustand ist charakterisiert durch ein unkontrolliertes Schwappen der Flüssigkeit am Boden des Kolbens. Damit verbunden sind ein reduzierter Leistungseintrag, schlechte Durchmischung und verringerter Gas-Flüssigkeits-Stofftransfer.

Erniedrigung der Schüttelfrequenz n
Erhöhung des Füllvolumens VL
Erniedrigung der Größe des Schüttelkolbens d
Erniedrigung der Viskosität

Nein

Koaleszenz ist das Verbinden zweier Bläschen oder Tröpfcehn zu einer großen Blase oder Tropfen, nachdem sie sich berührt haben. Die Oberfläche des gebildeten „Tröpfchens“ ist nun kleiner als die Summe der einzelnen Tröpfchen, es findet also eine Verkleinerung der Oberfläche statt.
Ist Salz vorhanden, bleiben die beiden Bläschen getrennt. Die Oberfläche bleibt größer und somit kann auch mehr Sauerstoff transportiert werden.

Die Koaleszenz ist abhängig von der Ionenstärke. Je höher diese ist, desto eher ist das System koaleszenzgehemmt. Bis zu einer Ionenstärke von 0,2 mol/L ist kaum eine Inhibition der Koaleszenz zu sehen. Dann nimmt die Koaleszenz drastisch ab. Ab einer Ionenstärke von 0,4 mol/L gilt ein System als vollständig koaleszenzgehemmt.

Ionenstärke
- Hohe Ionenstärke verringert die Koaleszenz

Oberflächenaktive Stoffe
- Emulgatoren oder Tenside reduzieren die Koaleszenz
- Demulgatoren erhöhen die Koaleszenz (auch wenn sie nur in nicht-begasten Systemen aktiv sind)

Die hydrophilen, negativ geladenen Köpfe der Fettsäuren zeigen nach außen. Sind keine Kationen vorhanden, so ist nur eine geringe Ionenstärke vorhanden, die Koaleszenz ist also hoch.


Sind Kationen vorhanden, so lagern diese sich an die negativen Ladungen. Die Ionenstärke ist nun hoch, wodurch die Koaleszenz sinkt.

Durch die Begasung hebt sich der Füllstand. Man hat also weniger Platz nach oben. Das muss man beachten, da sonst der Schaum in den Abgasfilter und dann kann man diesen nicht mehr verwenden. Also bei der Berechnung immer daran denken!

a) Mikrobiologie
    - C-Quelle (z.B. Glucose)
    - N-Quelle
    - Vitamine
    - Spurenelemente

b) Verfahrenstechnik
    - pO2
    - pCO2
    - Verdunstung
    - Schaum
    - hydromechanisher Stress
    - Emulsionsbildung

Biologische Parameter
- Wachstumsrate
- Rate der Substrataufnahme
- Produktsynthese
- Produktsekretion

Physikalische Parameter
- Gas-Flüssigkeit-Sauerstofftransfer
- Diffusion in mycellischen Flocken
- Inhomogenität (schlechtes Durchmischen / vor allem bei großen Fermentern)
- Hydromechanischer Stress

1. O2-Zufuhr
2. CO2-Entfernung
3. Emulgieren einer 2. flüssigen Phase
4. Mischintensität
5. Hydromechanischer Stress / Aufbruch der Zellen
6. Suspension von Feststoffen
7. Verdunstung von Wasser
8. Schaum
9. Wärmeentfernung
10. Spezifischer Leistungseintrag

1.- 9.: biologischer Sensor
10: kein biologischer Sensor

1. Rührintensität
2. Begasungsintensität

Das Bild:
- Y-Achse: Rührintensität
- X-Achse: Besagungsintensität
- Beschriftung 1 - 6 von oben links bis unten links (im Uhrzeigersinn)

1) Schaden der Zelle
2) Kosten
3) Schaum
4) zu geringes Rühren
5) Sauerstofflimitation
6) CO2-Limitierung

1) gibt es bei gram-positiven Bakterien nicht

Rührreaktor
Overflow reactor
Self inducing reactor
Recycle reactor
Driving jet reactor
Ramjet reactor
Bubble column
Airlift reactor
Trickle bed reactor
Mammoth loop column
Perforated tray reactor
Paddle wheel reactor

Einige Substanzen können bio(techno)logisch leichter hergestellt werden, weil sie auch in der Natur vorkommen

Hohe Selektivität, dh MOs können selektiv etwas nehmen, wobei die Ausgangsstoffe nicht rein sein müssen

Reaktion findet "in einem Topf" statt. Es ist keine Aufarbeitung nötig.

Man hat schon die physiologischen Bedingungen (da es ja in dem MO stattfindet und diese meist ähnliche Bedingungen benötigen)

Man hat mit dem MO einen selbstreproduzierenden Katalysator (günstig)

Kapazität kann leicht erhöht werden ohne das Benötigen neuer Investitionen (Optimierung der Prozesse -> Erhöhung der Kapazität)

keine Recylierung/Aufarbeitung nötig, da das Substrat verbraucht wird

Es entstehen keine gefährlichen/giftigen Substanzen. Es kommt zu keinen exothermen/sich beschleunigenden Reaktionen

Verwendung von nachwachsenden Ausgangsmaterialien

weniger Nebenprodukte und wenn doch dann sind sie biologisch abbaubar

Da physiologische Bedingungen:
  - geringe Reaktionsrate
  - großes Volumen,wenn man viel Produkt will

Man erhält eine stark verdünnte Lösung mit dem Produkt, da die MOs keinen hohen osmotischen Druck aushalten (Aufarbeitung ist teuer)

Biotechnologie arbeitet oft mit Industrieabfall (zb Melasse). Die MOs holen sich selektiv ihre Substanzen heraus. Der "Dreck" bleibt aber da

Man kann nur in wässrigen Lösungen arbeiten

Viel Biomasse am Ende (Entsorgung teuer/schwierig)

Equipment ist teuer (groß, Edelstahl, muss sterilisierbar sein)

Hohe Kühlungskosten

Rückwärts Integration

Hohe Kosten für Entsorgung, bzw. Abwasserkosten sind hoch

Konkurrenz gegen Chemie (also neu vs alt)
a) Wissenschaftliches Verständnis ist noch nicht so weit
b) lange Entwicklungszeit
c) Erkenntnis und Zuversicht sind nicht sehr hoch

HL = DR
d = DR/3
Baffle: 0,1 DR
L = d

Rührer:
Höhe des Rührerblattes: d/5
Breite des Rührblattes: d/4

HR/DR = 3
HL/DR = 2
dL/DR = 0,75
L1/DR = 0,375

Rührer:
Höhe des Rührerblattes: d/5
Breite des Rührblattes: d/4

1. Propellor-Rührtyp
2. Schaufelrührer
3. Scheibenrührer
4. MIG-Rührer / INTERMIG
5. Ekato Mizer-disc
6. Wendelrührer

a) 0,33
b) 0,2
c) radial
d) 3 - 7 m/s
e) turbulent
f) 4,6
g) <10
h) Flüssig/Flüssig Dispersion, Belüftung (ohne Scherkräfte)

1. Messung des Verbrauchs von elektrischer Leistung durch den Motor
-> Messung von vollem Fermenter und Messung, wenn nur ganz wenig Flüssigkeit im Fermenter ist (er darf nicht ganz leer ist)
[beachtet nicht die ganzen Verluste]

2. Messung der Drehkraft der Rührerachse
-> Faden um den Fermenter wickeln, dann um eine Rolle (reverse roller) und dann an ein Gewicht, das auf einer Waage liegt. Rührer an, der Faden wird aufgewickelt und das Gewicht hebt sich.
[man misst die Gleitringdichtung mit! Nur die Welle drehen lassen und abziehen]

3. Messung der Drehkraft, die nötig ist einen befestigten Reaktor zu erhalten
-> Direkte Messung hinter der Gleitringdichtung,ist aber schwer in der Biotechnologie. Mit Hohlwelle möglich: Da drin ist nur noch eine Welle (Stab), der dreht sich innen, die Messung findet außen statt

4. Messung der Hitzegenerierung im gerührten Medium
-> MEssung am Ende, man guckt wie viel Wärme entsteht

Fermenter mit 0.05 M Salzlösung:
Die Ionenstärke ist nochh relativ gering, daher kann es nur Koaleszenz kommen.
Direkt nach dem Rührer findet man kleine Blasen, da diese von dem Rührer zerschlagen werden. Dann können sich jedoch die Blasen wieder verbinden, so dass sich vor dem Rührer große und kleine Blasen befinden können.

Fermenter mit 0.2 M Salzlösung:
Die Ionenstärke ist hoch, daher kommt es zu keiner Koaleszenz. Sowohl vor, als auch hinter dem Rührer kommen nur kleine Blasen vor.

Re > 10^4

∆f/dmax >10

∆f/Id >200

1.Dispersion der Tropfen
2.Hydromechanischer Stress der Mikroorganismen
3.Dispersion der Bläschen

•Höhere Alkane als C-Quelle
•Pflanzenöl als C-Quelle
•Mikrobielle oder enzymatische Umsetzung mit  wasserunlöslichen organischen Edukten
•Fermentationen mit in-situ Produktextraktion

Der Tropfendurchmesser resultiert aus dem dynamischen Gleichgewicht von Koaleszenz und Auseinanderbrechen.
Das Auseinanderbrechen ist gut erforscht. Es kann über verschiedenen Größen gut beschrieben werden. Zu einer Koaleszenz kann es kommen, muss es aber nicht. Die Koaleszenz ist immer noch schwer zu beschreiben. Sie ist größenabhängig, denn die Zeit für die Koaleszenz steigt mit der Zirkulationszeit, die wiederum mit der Größe des Reaktors steigt.

Gefäß 1: große Blasen
Gefäß 2: kleine Blasen
In beiden Gefäßen ist gleich viel Öl (zweite Phase), allerdings bekommen die Mikroorganismen nur in dem zweiten Gefäß genug Öl. Die Blasen sind mehr verteilt und überall. Dadurch steigt auch die relative Reaktionsrate, denn die Mikroorganismen brauchen das Öl als C-Quelle

Die Köpfe der Fettsäuren sind negativ geladen. Dadurch stoßen sich die einzelnen Öltröpfchen ab und verbinden sich nicht. Gibt man nun Salz dazu, sind Kationen vorhanden. Die Fette sind nun nicht mehr negativ geladen und können sich näher kommen und somit auch verschmelzen. Die Koaleszenz steigt also und die Öltröpfchen werden großer.
Gibt man einen Emulgator dazu, sorgt dieser dafür, dass die Öltröpfchen feiner verteilt werden, sich aber nicht verbinden. Die Oberflächenspannung sinkt durch die Emulgatoren und die Tröpfchen halten sich nicht mehr zusammen. Die Koaleszenz sinkt und die Bläschen werden kleiner.

Wenn die Mikroorganismen dazu neigen große Pellets zu bilden (z.B. Aspergillus niger), so werden die Zellen im Inneren keine Nährstoffe bekommen. Es entstehen tote Zonen. Der hydromechanischer Stress sorgt also dafür, dass die Pellets nicht zu groß werden.

Der Leistungseintrag steigt, wenn die Rührgeschwindigkeit steigt. Steigt diese, so steigen die hydromechanischen Beanspruchungen und die Pellets, bzw. die Hyphen werden kleiner.

In einer kontinuierlichen Kultur werden die Substrate (z.B. Glucose) nur in geringen Mengen dazugegeben. Der Pilz wächst nicht so schnell und dadurch werden die Hyphen allgemein nicht so lang.

Von Außen nach Innen:

L1: dichte und feine Filamente. Es besteht ein vollkommenender Kontakt zur Außenwelt

L2/L3: dichtere Filamente. Weniger Kontakt zur Außenwelt. Weniger Substrate gelangen zu den Zellen.

L4: Tote Zone. Keine Nährstoffe gelangen in das Innere. Das Pellet wird hohl, die Hülle wird immer dünner bricht irgendwann auseinander (abhängig von der hydromechanischer Belastung).

Wenn der Mikroorganismus viel Sauerstoff braucht, muss man viel rühren. Dadurch werden die Pellets kleiner und die Viskosität steigt. Dann muss man wieder mehr rühren und die Viskosität steigt… bis die Fermentation nicht mehr zu verwenden ist.

Grobe Technik
1.Mikroskopieren (qualitativ)
2.Mikroskopische Bilder anfertigen und mittels statistischer Methoden und Bildverarbeitungsprogrammen auswerten
3.Messen der Extinktion des Überstands bei 260 nm um das Freisetzen von Nukleotiden zu untersuchen
4.Proteinbestimmung des Überstands
5.Aktivitätsmessung der intrazellulären Enzyme im Überstand (nicht bei sekretierenden Organismen)
6.Atmungsrate in O2-Messzellen bestimmen
7.Ausplattieren und koloniebildende Einheiten bestimmen
Feine Technik

Sie kommen nur im Inneren einer Zelle. Werden sie in der Nährbrühe detektiert, heißt das, dass die Zellen kaputt sind. Je stärker man rührt, desto mehr Zellen werden zerstört, desto mehr Nukleotide sind in der Nährbrühe und desto höher ist das Extinktionssignal bei 260nm.

Die kleinen Wirbel, die bei starken Rühren entstehen, sind größer als die Bakterien selber. Da die Wirbel nur für MOs gefährlich sind, die größer als die Wirbel selbst sind, sind diese für das Bakterium nicht gefährlich

Der maximale lokale Leistungseintrag (P/V)max

Variation der Anzahl der Rührer
Weniger Rührer müssen sich schneller drehen für den gleichen Leistungseintrag. Es kommt zu hohen Spitzeneinträgen.

Variation der Höhe der Blattrührer
Ist die Höhe geringer, haben die Rührer weniger „Griff“. Sie müssen schneller drehen und es kommt zu einer höheren Belastung.

Variation des Winkels des Rühres
Je kleiner der Winkel, desto besser kommt der Rührer durch die Flüssigkeit. Er muss schneller drehen und es kommt zu einer höheren Belastung.

Variation ob mit oder ohne Stromstörer
Ohne Stromstörer müssen die Rührer schneller drehen und es kommt zu einer höheren Belastung.

Wenn man begast und die Rührgeschwindigkeit erhöht, so werden die Luftblasen zerstört, was die empfindlichen Hybridoma-Zellen schädigt. Daher sinkt die Zellkonzentration bei Begasung. Je schneller man dreht, desto stärker ist der Abfall.

Die Gasblase wandert durch das Medium nach oben
Die Blase steigt weiter nach oben bis nur noch eine dünne Schicht Flüssigkeit zwischen Gasblase und Oberfläche da ist.
Der dünne Film zwischen Oberfläche und Gasblase reißt
Flüssigkeit des Films „raßt“ runter.  Oberfläche dehnt sich aus und kontrahiert.
Die Flüssigkeit formt sich zu einem schnellen Strahl. Einige kleine Tropfen springen oben raus.
Passiert innerhalb von 1,7 * 10-4 Sekunden

Motor : 10 - 12 %

Gummiring: 0,1 %

Getriebe: 8 %

Gleitringdichtung: 11 - 20 %

Rührer direkt übereinander: wirkt, wie ein großer Rührer und nur an einer Stelle kommt es zu einer Vermischung

kleiner Abstand: Wirbel überschneiden sich stark, größeres Mischgebiet aber nicht an den äußeren Stellen (oben/unten)

großer Abstand: Wirbel überschneiden sich gar nicht, nur unten und oben Durchmischung

-> Wirbel sollten sich etwas überschneiden, damit es zu einer idealen Durchmischung kommt

1. Es bilden sind festhaltende Höhlen (clinging cavities)

2. Erste große Höhle (large cavities) entstehr

3. Anzahl der großen Höhlen erhöht sich von 1 -> 6

4. 6 große Höhlen wachsten

5. Bubble flow direction

1. Der untere Rührer agiert wie ein einstufiger Rührkessel. Er dispergiert und zerstreut das komplette Gas

2. Alle obere Rührer laufen unter anderen Bedingungen. Sie müssen nicht mit der kompletten Gasmenge hantieren, nur mit dem Teil, der zum zirkulierenden Fluss gehört

3. Nur der untere Rührer verhindert Koaleszenz

4. Der Leistungseintrg der oberen Rührer in die Flüssigkeit ist höher

1. Flooding = Fluten
Gas steigt durch Rührer auf ohne verteilt zu werden

2. Plug flow = Propfenströmung
Gas wird durch den Rührer verteilt, keine Gasrückvermischung

3. Gasrecirculation = Gasrückvermischung
Nur im unteren Bereich kommt es zur Gasrückvermischung

4. Komplette Gasrückvermischung
Aufsteigende Gasblasen weredn in die Rührerzone zurückgezogen -> will man haben

5. Surface aeration = Gasansaugen
Gas wird von der Flüssigkeitsoberfläche inden Reaktor eingesogen

1. Reduzierung des Leistungseintrags in die Flüssigkeit

2. Gas- und Füllvolumen wird erhöht

3. Reduzierung des durchschnittlichen Sauerstoffkonzentrationsgradienten in Bezug auf die Reaktorhöhe

4. Erhöhung der gleichmäßigen Verteilung von Bläschen/Sauerstoff

5. Reduzierung des unterschiedlichen Leistungseintrag zwischen dem unteren und oberen Rührer

Blasensäule: Von Unten wird Sauerstoff reingepumt, der durch Rührer zerteilt und verteilt wird.

Membranbegasung: Im dem Fermenter befindet sich eine gaspermeable Membran, durch die begast wird.

Die meisten Zelllinien heutzutage sind stabil genug für die Blasensäule

a)Obliga aerob
Wachstum nur oben. Die Zellen nehmen den Sauerstoff auf und es steht den unteren nicht mehr zur Verfügung. Durch Diffusion gelangt etwas Sauerstoff in den Agar, daher nimmt die Konzentration der Zelldichte nach unten  hin ab.

b)Anaerob
Wachstum nur unten, wo kein Sauerstoff durch Diffusion hinkommt.

c)Fakultativ aerob
Wachstum überall, allerdings wird Sauerstoff bevorzugt, daher ist oben mehr Wachstum. Anaerober Stoffwechsel verbraucht mehr ATP, daher findet man unten weiniger MOs.

d)Mikroaerophil
Weder kein Sauerstoff, noch viel Sauerstoff sind gut. Sauerstoff wird benötigt. Aber in reduzierter Konzentration. Wachstum dicht unter der oberen Schicht.

e)Aerotolerant
MOs brauchen/nutze keinen Sauerstoff, aber die Gegenwart macht ihnen nichts. Überall Wachstum.

1.Der gesamte Metabolismus wird heruntergefahren ohne irgendwelche (biochemischen) Konsequenzen. Der MO nimmt den Sauerstoff, den er bekommt.

2.Bildung von Säure und Alkohol verschlechtert die Umweltbedingungen des Mikroorganismus. Glucose wird in die Zelle geschleust, aber im Citratzyklus nicht abgebaut. NADH samelt sich. Es wird Lactat gebildet. Ansäuerung und die Bildung von Ethanol führt schließlich zum Tod.

3.Der Mikroorganismus reagiert mit weniger Produktbildung und zeigt ein enges Optimum.

4.Der Mikroorganismus verändert komplett seinen Metaboliusmus, z.B. Anschalten neuer Wege.

5.Der Mikroorganismus stirbt.

a) b) Sowohl zu viel, als auch zu wenig Sauerstoff führt zu einer Hemmung der Produktion.

c) Unter microaeroben Bedingungen wird Xylitol gebildet.

Stromgestört
Ist das System stromgestört, so ist die Oberfläche unruhiger und welliger. Das bedeutet, die Oberfläche ist größer  und somit kann mehr Sauerstoff eingetragen werden. Daher ist die ganze Zeit über Sauerstoff gelöst und wird nicht aufgebraucht.
Die Prodigiosinkonzentration steigt, also ist die Produktion von Sauerstoff abhängig. Asparaginase dagegen wird kaum gebildet. Sie wird wahrscheinlich nur bei geringer/keiner Sauerstoffkonzentration bevorzugt gebildet.

Nicht stromgestört
Ist das System nicht stromgestört, so wird weniger Sauerstoff eingetragen. Die Sauerstoffzufuhr reicht nicht aus und es wird zu einem sauerstofflimitierten System. Da nur wenig Sauerstoff vorhanden ist, wird mehr Asparaginase gebildet. Prodigiosin dagegen wird nicht gebildet.

1.Diffusion vom Kern der Gasblase zur Phasengrenzfläche gas/flüssig

2.Bewegung durch die Phasengrenzfläche gas/flüssig

3.Diffusion durch die relativ undurchmischte flüssigkeitsseitige Grenzfläche (limitierender Schritt!!!)

4.Transport des gelösten Sauerstoffs durch die Flüssigphase

5.Transport durch die zweite relativ undurchmischte
flüssigkeitsseite Grenzfläche, die sich um der Zelle herum befindet

6.Transport bis an die Zelle

7.Transport durch die Zellmembran und an die Stelle, an der es dann zu einer intrazellulären Reaktion kommt

•Kern der Gasphase: Konzentration konstant

•Gasseitige Grenzfläche: zu vernachlässigende Abnahme der Konzentration

•Phasengrenzfläche (PG) gas/flüssig: geringer Konzentrationssprung

•Diffusion durch die relativ undurchmmischte flüssigkeitsseitige Grenzfläche in den Kern der Flüssigkeit: Konzentration sinkt

•Kern der Flüssigphase: Konzentration konstant

•Aus dem Kern der Flüssigphase an die Oberfläche der Biophase: geringer Konzentrationssprung

•Gekoppelte Diffusion und Reaktion im Inneren der Biophase

Der absolute Druck in der Mitte des Flüssigkeitslevels pabs wird durch den Druck im Kopfraum p und durch den hydrostatischen Drucks  der Flüssigkeit bestimmt.

Stop flow Methode
Idee:Begasung wird während der Begasung ausgeschaltet. Die OUR (Sauerstoffaufnahmerate) kann aus dem Abfall des DOT (gelöster Sauerstoff) berechnet werden. Dann wird die Begasung wieder angeschaltet. OUR ist als kLa bekannt und kann dann aus der Steigung des DOT-Signals berechnet werden.
Problem:In aktiv atmenden Kulturen sinkt der DOT sehr schnell. Kleine Blasen haben keine ZeiFermentationsbrühe zu verlassen. Das bedeutet, dass der Massentransfer dieser kleinen Blasen weiter geht und der OUR ist falsch. Die Messgenauigkeit ist sehr gering. Die Methode ist nicht empfehlenswert.

Gassing-out Methode
Idee:Steriles Medium wird mit Luft begast. Dann wird die Begasung auf Stickstoff umgestellt, so dass der Sauerstoff entfernt wird. Der kLa-Wert kann aus dem zeitlichen Verlauf des DOT-Signals berechnet werden.
Problem:Der Stickstoff nimmt Sauerstoff aus der Flüssigkeit auf. Daher ist die Konzentration d Gasphase unbekannt und der laufende Gradient undefiniert. Diese Methode ist nicht bei hohen kLa-Werten nicht zu verwenden.






Gassing-in Methode
Idee:Ein steriles Medium wird mit Stickstoff begast (oder unter Vakuum gesetzt), damit der gesamte Sauerstoff verschwindet. Dann wird mit Luft begast. Der kLa-Wert wird aus dem zeitlichen Verlauf des DOT-Signals berechnet.
Problem:Es dauert lange bis das steady-state erreicht wird. Diese Zeit ist länger als die, die das sterile Medium benötigt, um eine komplette Sauerstoffsättigung zu erreichen. Das bedeutet, die Bedingungen sind nicht genau definiert. Die DOT-Elektrode wird auf der halben Reaktorhöhe installiert. Die Methode scheint sicher zu sein.

Sulfit Oxidation Methode
Idee:Eine wässrige Salzlösung mit einer Ionenstärke, die der des zu fermentierenden Mediums entspricht, wird begast. Co2+ wird als Katalysator dazugegeben.  Der DOT ist bei 100% Luftsättigung. Sulfit-Medium mit einer definierten Konzentration wird dazugegeben.  Sulfit wird zu Sulfat oxidiert, woraufhin der DOT auf 0% sinkt. Das ganze Sulfit ist aufgebraucht, wenn das DOT-Signal wieder steigt. Der kLa kann aus der Stöchiometrie der Sulfitoxidation und der Zeit mit zu Aufbrauch des Sulfits berechnet werden.
Problem:Diese Methode wird in einer Modelllösung ausgeführt, die etwas anders als das Medium ist.

Pressure step Methode
Idee:Steriles Medium oder eine biologisch aktive Fermentationsbrühe wird begast. Dann wird der Druck im Kopfraum des Fermenters um 0,2 bar erhöht. Der kLa-Wert kann dann aus dem zeitlichen Verlauf des DOT-Signales berechnet wird.
Vorteil:Der Sauerstoffpartialdruck steigt in allen Blasen gleich. Somit ist der laufende Konzentrationsgradient genau definiert. Der Blasendurchmesser steigt etwas, während der gas hold-p sich nicht sehr ändern. Scheint die beste Methode zu sein.

Die stationäre Methode mittels Abgasanalyse ist die genaueste und sollte wenn möglich verwendet werden.

Die Löslichkeit von Gas sinkt bei Erhöhung der Temperatur. 
CO2 ist in Wasser besser löslich als Sauerstoff oder Stickstoff.

Den Einfluss der Ionenstärke auf die Sauerstofftransferrate wurde mittels Sulfitversuch untersucht. Am Anfang wurde in allen Ansätzen 0,2 mol/L NasSO3 dazugegeben. Also war überall gleich viel Sulfit drin. Dann wurden verschiedene Konzentrationen an Na-Sulfat dazugegeben. Je höher diese Konzentration war, desto langsamer lief die Reaktion ab und desto geringer war die OTR.
Das bedeutet, man muss für den Sauerstofftransfer das Medium (die Zusätze) beachten, denn die Löslichkeit von Sauerstoff wird verringert, je mehr Zusätze sich im Medium befinden.

Der Sauerstofftransfer ist allerdings nicht nur von der Sauerstoffkonzentration und –löslichkeit abhängig, sondern auch von der Salzkonzentration.

Sinkt der relative Diffusionskoeffizient, so steigt die relative Viskosität. Das liegt daran, dass je mehr Zusätze im Wasser sind, desto geringer ist der Diffusionskoeffizient und desto höher wird die Viskosität

Die optische Dichte sinkt bei Zugabe von Zusatzstoffen, wie Zucker oder Salzen. Das liegt daran, dass weniger Sauerstoff gelöst werden kann und die MOs somit weniger Sauerstoff zur Verfügung haben. Eine voreilige Interpretation könnte zur Interpretation führen, dass die Zelle osmotische Probleme hat.

Steigt die Ionenstärke, so steigt auch die Oberfläche der Blasen. Das liegt daran, dass es nicht mehr so schnell/oft zur Koaleszenz kommt. Dadurch bleiben die Blasen kleiner und die gesamte Oberfläche aller Blasen größer (zwei kleine Blasen haben eine größere Oberfläche als eine größere Blase). Ab einer Ionenstärke von 0,4 mol/L kommt es zu einer Sättigung (vollständige Koaleszenthemmung).

Bis zu einer Ionenstärke von 0,4 mol/L steigt der kLa-Wert an. Bei höherer Ionenstärke kommt es zu einem parabellförmigen Abfall, was sich aus der Sättigung der Koaleszenzhemmung ergibt. Nach dem Maximum hat a keinen Einfluss mehr auf den kLa-Wert, jedoch der kL-Wert. Da dieser abfällt, fällt auch der kLa-Wert.

1)Leistungseintrag (durch Rühren und Gasexpansion), Einfluss auf den kL- und a-Wert durch Generierung kleinerer Blasen

2)Veränderung im gas hold-up und dadurch auch der Massentransferbereich durch die Gasgeschwindigkeit

3)Abfall der Sauerstoffkonzentration in Blasen auf dem Weg durch den Reaktor

4)Sauerstoffkonzentration des Einlassgases

5)Druck (im Kopfraum, hydrostatischer Druck)

6)Temperatur (Beeinflusst durch den Diffusionskoeffizient, Löslichkeit, …)

7)Veränderung der Koaleszenz, charakterisiert die Fermentationsbrühe durch Bildung von Produkten

8)Einfluss von grenzflächenaktiver Stoffe und Antischaum mittel auf den kLa-Wert (kL-Werte werden normalerweise kleiner, a-Werte größer)

9)Veränderung der Sauerstofflöslichkeit durch Substratverbrauch oder Produktbildung

10)Veränderung des effektiven Diffusionskoeffizienten durch Substratverbrauch oder Produktbildung

11)Erhöhung der Viskosität durch Anreicherung von (filamentösen) Zellen oder polymeren Produkten

12)Bildung von schlecht durchmischten oder stagnierenden Zonen im Reaktor, wenn die Fermentationsbrühe eine nicht-newtonsche Flüssigkeit enthält

13)Bildung von Zellaggregaten und Pellets mit schlechter Versorgung in der Mitte

14)Vorhandensein von gelösten festen Partikeln (senkt den kLa-Wert bei Partikeln < 3mm, erhöht bei größeren Partikeln)

15)Vorhandensein einer zweiten (organischen) Phase mit einer höheren Sauerstofflöslichkeit

MOs brauchen CO2 zum Anwachsen in der log-Phase, denn CO2 wird zum Aufbau von z.B. Aminosäuren benötigt und am Anfang produzieren die MOs zu wenig. im späteren Wachstum hemmt CO2 das Wachstum

•Glykolyse

•Pentose-Phosphat-Zyklus

•Oxidative Phosphorylierung

•Citratzyklus

•Lactatfermentaton

•Anaplerotische Reaktionen
Durch fehlende anaplerotische Reaktionen im Citratzyklus führt dazu, dass kein Wachstum zu sehen ist, wenn man ein Substrat (z.B. Oxalacetat) aus dem Zyklus entfernt.
Teil der anaplerotischen Reaktionen sind CO2 fixierende Prozesse. Ist dieses nicht vorhanden, so steht der komplette Citratzyklus still

•Anabolische Reaktionen (Bsp.: Synthese von AS)

Scale-up
Für große Produktionen

Scale-down
Neue Bedingungen testen (z.B. neuer MO)

1.Sauerstoff
Sauerstofftransfer von den Blasen in die Flüssigkeit findet überall im Reaktor statt, allerdings unterscheidet sich die Transferintensität zwischen Rührerzone und dem restlichen Volumen deutlich.

2.Gelöste Komponenten, die zugefüttert werden (C-Quelle, Säure/Base)
Die Feedlösung wird normalerweise  nur an einer Stelle im Reaktor dazugegeben. Die Komponenten müssen noch durch die Rührer verteilt werden. Eine mögliche Lösung ist die Zufütterung an unterschiedlichen Stellen

Der Leistungseintragende ist einem Rührkessel ist der Rührer. In einem Schüttelkolben ist es die Kesselwand, die in Kontakt mit der rotierenden Flüssigkeit kommt.
Würde man die „konventionelle“ Powernumber nutzen, könnte man verschiedene Füllhöhen nicht in Zusammenhang bringen, denn die Kontaktfläche der Flüssigkeit ist unterschiedlich und die Kontaktfläche (Kolbenwand) ist der Leistungseintragende.
Verwendung der modifizierten Powernumber sorgt dafür, dass man die Powernumber in Abhängigkeit von Re setzen kann

Das System tendiert zu "in Phase", wenn
a) die Viskosität gering ist
b) der Schütteldurchmesser groß ist
c) das Füllvolumen hoch ist
d) die Rührfrequenz hoch ist
e) der Schütteldurchmesser klein ist

Das System tendiert zu "in Phase", wenn
a) die Viskosität hoch ist
b) der Schütteldurchmesser klein ist
c) das Füllvolumen gering ist
d) die Rührfrequenz gering ist
e) der Schütteldurchmesser groß ist

Auch Wasser kann „außer Phase“ geraten.

Ist Wasser „in Phase“ und man erhöht die Schüttelfrequenz, so kann das passieren.

Ist Wasser „außer Phase“ muss man die Schüttelfrequenz absenken, damit Wasser wieder „in Phase“ kommt. Man muss die Schüttelfrequenz allerdings weiter absenken, als die Frequenz, in der Wasser normalerweise schon „in Phase“ ist.

Die Schüttelfrequenz sollte daher langsam erhöht werden, damit das „außer Phase“-Phänomen erst gar nicht auftritt.

Je weniger Volumen sich in dem Kolben befindet, desto schneller gerät das System „außer Phase“ (desto geringer ist die Schüttelfrequenz beim „außer Phase“ geraten).

Kleine Stromstörer können den Leistungseintrag erhöhen. Zu große verringern allerdings den Leistungseintrag.

1.Screening-Experimente immer mit anorganischen Medien, keine komplexen Medien verwenden

2.Danach die Produktivität des selektierten Stamms auf dem Medium, was dann für die Produktion verwendet wird, testen (was im allgemeinen komplexe Inhaltsstoffe beinhaltet).

Wenn z.B. der Wildstamm filamentös ist, ist die Viskosität dadurch im Medium ziemlich hoch. Wird der Stamm verändert und der Stamm verliert seine filamentöse Struktur, so ist das ganze System nicht mehr so viskos und das Experiment gerät nicht so leicht "außer Phase"

Eine Berechnung im Rührkessel ist schwierig, da viele Einflussfaktoren vorhanden sind
•Schaum
•Gasabtrennung
•Koaleszenz
•Gasrezirkulation
•Gasdispersion
•Blasenbildung

Plastik ist eine nicht benetzend, Glas dagegen ja. Das bedeutet, dass der Flüssigkeitsfilm bei einem Glaskolben größer ist. Da diese Fläche für die OTR entscheidend ist, ist für den Sauerstofftransfer ein Glaskolben besser geeignet.

Der Schaum wirkt zunächst positiv auf den Sauerstofftransfer aus.

Ist allerdings zu viel Schaum da, so wird der Sauerstofftransfer inhibiert. Er kommt nicht mehr durch den Schaum.

Allgemein ist die Sauerstofftransferrate bei Schaum sehr undefiniert.

•Höherer Massentransfer bei geringer Schüttelfrequenz

•[Höherer hydrodynamischer Stress bei identische Schüttelfrequenz]

•Stromstörer werden normalerweise mit der Hand hergestellt. Daher sind sie immer unterschiedlich groß und das führt zu signifikanten Unterschieden im Sauerstofftransfer.

•Zu große Stromstörer können die Zirkulation der Flüssigkeit stören und das System gerät „außer Phase“

•Komplizierte und chaotische Strömungsregime können entstehen, was nicht mechanisch modelliert werden kann. Massentransfer kann nicht berechnet werden, wie in nichtstromgestörten Kolben, da sich Blasen und Tröpfchen bilden können

•Das System reagiert sehr empfindlich auf oberflächenaktiven Stoffe; Schaum. Eine dünne Schaumschicht erhöht den Massentransferbereich. Eine dickte stagnierende Schaumschicht verhält sich wie eine zusätzliche Diffusionsbarriere

•Wenn der Deckel durch Spritzen nass wird, kann der Gastransfer limitiert werden

•Starkes Wachstum an der Wand durch Spritzen

•Hitzeentfernung ist schwierig

Massentransfer:
1.Durch den Wattestopfen
2.Gas/Flüssigkeitsmassentransfer

Man kennt zum Beispiel die genaue Sauerstoffkonzentration im Kolben nicht.

Glaskolben sind allgemein besser als Plastikolben, da Glas benetzend ist und somit die Massentransferfläche größer ist. Es wird mehr Sauerstoff aufgenommen. Ein Kolben mit breitem Hals ist besser als mit einem engen Hals,da der Sauerstoffeintrag nur durch den Hals geschieht. Je breiter der Hals, desto mehr Sauerstoff kann in den Kolben diffundieren.
Beim Verschließen mit Aluminium kann es leicht zu Verunreinigungen kommen, daher ist ein Wattestopfen besser.

RAMOS-Anlagen (Respiration Activity Monitoring System)

Gerät für eine mitlaufende Messung der O2 und CO2 Transferrate

a) klein
b) groß

a) schnell
b) langsam

a) hoch
b) gering

a) hoch
b) gering

a) hoch & unterschiedlich
b) gering & gleichmäßig

a) klein
b) groß

a) groß
b) klein

a) klein
b) groß

a) hoch
b) gering

a) hoch
b) gering

a) hoch
b) gering

a) gering
b) hoch

a) gering
b) hoch

a) hoch
b) gering

a) gering
b) hoch

Großen Kolben

kleine Kolben

kleine Kolben

Mehr Stufen beim Rührer (gleiche Geschwindigkeit)

Schneller drehen

Höhe von Rührern verkleinern

Winkel verkleinern

Kleine Rührer

Stromstörer

KOLBEN: kleine Stromstörer

KOLBEN: größeres Volumen

durch Gasrezirkulation

bei Begasung

KOLBEN: geringes Volumen

KOLBEN: größere Kolben

KOLBEN: Schüttelfrequenz erhöhen

KOLBEN: hohe Viskosität

Hohe Produktausbeute/-bildung

Dispersion von Tröpfchen/Bläschen

Hydromechanischen Stress

MOs werden kleiner / Hyphenlänge geringer

Viskosität steigt bei filamentösen MOs

Gasrezirkulation

MOs wachsen besser

Säugetierzellen gehen kaputt

DOT steigt

kLa-Wert steigt

Mischzeit wird verringert

Besserer OTR

Schlechtere O2-Verteilung

Bessere Produktausbeute (Säugetierzellen)

Besseres Wachstum (Säugetierzellen)